Exogen zugeführte iPSCs stören die natürliche Reparaturreaktion endogener MPCs nach einer Knochenverletzung

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 9378 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die Förderung der Knochenheilung, einschließlich Frakturpseudarthrosen, ist aufgrund des begrenzten Erfolgs aktueller klinischer Behandlungsmethoden ein vielversprechendes Ziel für das Bone Tissue Engineering. Aufgrund ihrer vielversprechenden Regenerationsfähigkeiten gibt es umfangreiche Forschungsarbeiten zum Einsatz von Stammzellen mit und ohne Gerüste aus Biomaterialien zur Behandlung von Knochenbrüchen. Allerdings ist die relative Rolle von exogenen vs. endogenen Stammzellen und ihr Gesamtbeitrag zur In-vivo-Frakturreparatur nicht gut verstanden. Der Zweck dieser Studie bestand darin, die Interaktion zwischen exogenen und endogenen Stammzellen während der Knochenheilung zu bestimmen. Diese Studie wurde unter Verwendung eines standardisierten Bohrloch-Knochenverletzungsmodells an einer Maus zur Abstammungsverfolgung mit mesenchymalen Vorläuferzellen (MPC) unter normalen homöostatischen und osteoporotischen Bedingungen durchgeführt. Bohrlochverletzungen wurden mit einem Kollagen-I-Biomaterial behandelt, das mit und ohne markierte induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) beladen war. Mittels Lineage-Tracing wurde die Rolle exogener und endogener Stammzellen bei der Knochenheilung untersucht. Es wurde beobachtet, dass die Behandlung mit iPSCs bei intakten Mäusen nach der Verletzung im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen zu einer gedämpften Heilung führte. Bei der histologischen Untersuchung der Zellpopulationen zeigten iPSC-behandelte Bohrlochdefekte eine dramatische Verringerung der endogenen MPCs und der Zellproliferation an der gesamten Verletzungsstelle. Wenn jedoch die Eierstöcke entfernt wurden und bei den Mäusen ein osteoporoseähnlicher Phänotyp induziert wurde, führte die Behandlung mit iPSCs im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen zu einer erhöhten Knochenbildung. In Abwesenheit von iPSCs zeigten endogene MPCs eine robuste proliferative und osteogene Fähigkeit, Reparaturen durchzuführen, und dieses Verhalten wurde in Gegenwart von iPSCs gestört, die stattdessen das Schicksal von Osteoblasten annahmen, jedoch mit geringer Proliferation. Diese Studie zeigt deutlich, dass exogen zugeführte Zellpopulationen die normale Funktion endogener Stamm-/Vorläuferpopulationen während der normalen Heilungskaskade beeinflussen können. Diese Wechselwirkungen müssen besser verstanden werden, um Zell- und Biomaterialtherapien zur Behandlung von Frakturen zu ermöglichen.

Im Laufe des Lebens wird der Knochen als Reaktion auf Belastung, Stoffwechselveränderungen und Schäden (z. B. Brüche) kontinuierlich umgestaltet. Beim Menschen heilen Frakturen langer Röhrenknochen normalerweise innerhalb von 3 bis 4 Monaten1. Skelettstamm-/Vorläuferzellen, wie z. B. mesenchymale Stamm-/Vorläuferzellen (MPCs), spielen eine wichtige Rolle bei der Knochenheilung, da sie die Fähigkeit besitzen, sich in viele der an der Heilungskaskade beteiligten Zelltypen zu differenzieren (z. B. Chondrozyten, Osteoblasten und Osteozyten). sowie die Entzündungsnische (Immunmodulation) während des Reparaturprozesses beeinflussen2.

Trotz der intrinsischen Fähigkeit des Knochens, sich nach einer Verletzung zu regenerieren, gibt es mehrere Fälle, in denen der Knochen nicht in der Lage ist, von selbst zu heilen, und diese Verletzungen können aufgrund einer Vielzahl von Faktoren wie instabiler Frakturmechanik oder Krankheiten wie Osteoporose bestehen bleiben3. In diesen Fällen kann es zu einem nicht reparierenden Defekt kommen, der als Frakturpseudarthrose bezeichnet wird. Pseudarthrosen bei Frakturen zeichnen sich im Allgemeinen dadurch aus, dass die Heilung innerhalb von 6 bis 8 Monaten ausbleibt und es keine fortschreitenden Heilungszeichen gibt4. Es wird geschätzt, dass allein in den USA 100.000 Frakturen zu einer Pseudarthrose führen5. Daher ist die Förderung der Heilung von Frakturpseudarthrosen aufgrund der mangelnden Regenerationsfähigkeit des Defekts und seiner relativ hohen klinischen Inzidenz ein vielversprechendes Ziel für das Knochengewebe-Engineering.

Aufgrund ihrer vielversprechenden Regenerationsfähigkeiten gibt es umfangreiche Forschungsarbeiten zur Verwendung exogener Stammzellen (adulte und pluripotente) mit und ohne Biomaterialgerüste zur Behandlung von Knochenbrüchen6,7,8,9. Doch trotz des Potenzials der Stammzelltherapie bei der Frakturheilung mangelt es immer noch an Forschung, die die Interaktion von exogenen vs. endogenen Stamm-/Vorläuferzellen während des Frakturheilungsprozesses untersucht. Außerdem ist noch nicht klar, durch welche Mechanismen endogene MPCs zur Frakturheilung beitragen; Es gibt Hinweise darauf, dass sie sich differenzieren und zur Bildung neuen Gewebes beitragen10, außerdem können sie indirekt durch die Freisetzung von Wachstumsfaktoren/Zytokinen zur Förderung der Heilung beitragen6,10,11. Um die zellulären Mechanismen der Knochenheilung besser zu verstehen, muss ermittelt werden, wie exogene und endogene Stamm-/Vorläuferzellpopulationen während der Heilung in vivo miteinander interagieren. Ziel dieser Studie war es daher, die Wechselwirkung zwischen exogenen (induzierten pluripotenten Stammzellen, iPSCs) und endogenen (MPCs) Zellen während der Frakturreparatur zu untersuchen, um Einblicke in diese Mechanismen zu gewinnen und die Heilung bei Frakturpseudarthrosen zu verbessern.

Um die Heilung zu beurteilen, wurde eine hoch reproduzierbare Bohrlochverletzung in der proximalen Tibia7,12,13,14 in Verbindung mit einem Mausmodell zur Abstammungsverfolgung (Hic1cre-ERT2:RosatdTomato)15,16,17 erzeugt, wobei endogene MPCs nachträglich identifiziert werden können -Verletzung. In diesem Mausmodell sind die endogenen MPCs dauerhaft mit tdTomato-Post-Tamoxifen-Induktion markiert15,16. Um exogene Stammzellen im Reparaturprozess zu bewerten, wurden mit grün fluoreszierendem Protein (GFP) markierte iPSCs, eingebettet in ein Kollagen-I-Biomaterial14,18, in die Stelle des Bohrlochdefekts transplantiert. Die endogenen MPCs und exogenen iPSCs könnten dann während der Frakturheilung gleichzeitig mit den dualen Fluoreszenzmarkern verfolgt werden. Zusätzlich zur Verfolgung dieser Zellen nach der Fraktur verwendeten wir auch ein osteopenisches/porotisches Modell (Ovarektomie/OVX), um ein besseres Verständnis der Rolle exogener und endogener Stammzellpopulationen bei der Knochenheilung unter intakter homöostatischer bzw. nicht homöostatischer ( Krankheit) Bedingungen.

Alle Tierversuche wurden gemäß den Empfehlungen der Canadian Council on Animal Care Guidelines durchgeführt. Die Berichterstattung über diese Daten im Manuskript folgt den Empfehlungen in den ARRIVE-Richtlinien. Das Animal Care Committee der University of Calgary Health Sciences genehmigte alle in dieser Studie verwendeten Tierprotokolle und chirurgischen Verfahren (Ethics ID# AC16-0043).

C57BL/6-Embryonen (Tag 12,5) wurden geerntet, in Dulbecco's phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) gespült und mazeriert. Nach der Behandlung mit 0,25 % Trypsin wurde die resultierende Zellsuspension filtriert, um Trümmer zu entfernen, und in DMEM mit hohem Glucosegehalt (Gibco), 10 % FBS (Gibco), 1 × MEM No-Essential Amino Acids (Gibco), 50 Einheiten/ml Penicillin ausplattiert –Streptomycin (Gibco). Die resultierenden embryonalen Mausfibroblasten (MEFs) wurden zur zellulären Neuprogrammierung zur Produktion von iPSCs an Applied Biological Materials Inc. (Richmond, BC) geliefert. MEFs wurden mit den Lentiviren SFFV-OCT4, -SOX2 und -KLF4 transduziert. Nach einer Woche wurden ESC-ähnliche Kolonien mit Futterspendern in frische Vertiefungen überführt. Nach zwei Passagen auf Feederzellen wurden Maus-iPSCs nach UCalgary verschifft. Um GFP in das Genom zu integrieren, wurde CRISPR/Cas9 verwendet, um ein 6-kb-Transgen in den Maus-Safe-Harbor-ROSA26-Locus einzufügen, wobei die Technik der homologieunabhängigen gezielten Integration (HITI) verwendet wurde [136]. Für jede Nukleofektionsreaktion wurden für iPSCs 10 μl CRISPR-DNA aus 916 ng/μl und 10 μl DNA aus 719 ng/μl Cas9-DNA-Konstrukt gemischt mit 28,98 μl aus 414 ng/μl GFP-Konstrukt verwendet. Alle DNA-Konstrukte wurden in Wasser gelöst. Für jede Nukleofektionsreaktion wurden Konstrukte mit drei Millionen iPSCs mit dem Nukleofektionskit (Maus-Nukleofektor-Kit, Lonza, Kat.-Nr. VPH-1001) im Programm A-023 gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Nukleofizierte iPSCs wurden zwei Tage lang auf den mit Gelatine und MEFs beschichteten Platten mit ESC-Medium gezüchtet. Dann wurde FACS mit SSEA1-Marker durchgeführt. iPSCs wurden 5 Minuten lang bei 37 °C enzymatisch mit 0,25 % Trypsin verdaut. Einzelne Zellen wurden zweimal mit kaltem DPBS gewaschen und 15 Minuten lang mit konjugiertem SSEA1-PE mit einer Konzentration von 1 μg/ml (Santa Cruz: sc-21702 PE) gefärbt. Doppelt positive iPSCs für GFP und SSEA1 wurden in mit Gelatine beschichtete 96-Well-Platten sortiert, eine Zelle pro Well. Die Klone wurden sequenziert, um die korrekte Positionierung und Ausrichtung des Transgens im ROSA26-Locus zu bestimmen. Um zu bestätigen, dass die Zellen weiterhin funktionsfähige iPSCs blieben, wurden Teratomtests durchgeführt, bei denen 1.106 Zellen subkutan in den Rückenbereich von SCID-beigen Mäusen transplantiert wurden. Die Proben wurden fixiert, verarbeitet und in Paraffin eingebettet. Sie wurden auf eine Dicke von 10 μM geschnitten und mit Safranin O angefärbt.

Maus-iPSCs wurden routinemäßig auf mitotisch inaktivierten embryonalen Mausfibroblasten (MEFs) in T25-Flaschen (Fisher) kultiviert. Das Kulturmedium bestand aus Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Lonza) mit hohem Glucosegehalt, ergänzt mit 1 % nicht-essentieller Aminosäure, 1 % Anti-Anti, 15 % fötalem Rinderserum (FBS) und 0,1 mM β-Mercaptoethanol (alle Invitrogen). . Um die iPSC-Pluripotenz aufrechtzuerhalten, wurde das Kulturmedium mit 1000 U/ml Leukämie-Hemmfaktor (LIF) ergänzt. Die Zellen wurden routinemäßig nach Erreichen einer Konfluenz von etwa 80 % jeden dritten bis vierten Tag passagiert und in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 bei 37 °C gehalten. Eine Passage bevor die Zellen dem Kollagengerüst hinzugefügt wurden, wurden sie in mit Gelatine (0,1 %, Fisher) beschichteten Kolben kultiviert, um überschüssige MEFs zu entfernen.

Das Kollagen-I-Gerüst wurde nach zuvor veröffentlichten Methoden7,14,18 hergestellt. Fibrilläres Rinderkollagen I (3 mg/ml, PureCol, Advanced Biomatrix) wurde als 3D-Gel polymerisiert. Kurz gesagt, 80 % v/v 3 mg/ml Typ-I-Kollagenlösung wurde mit einer 1 Million Zellen/ml iPSC-Suspension und 20 % v/v Beta-Glycerinphosphat (βGP, Sigma Aldrich), gelöst in 5 × konzentriertem Dulbecco's modifiziert, gemischt Eagle's Medium (DMEM)18. Anschließend wurden 15 % FBS (Invitrogen), 1 % nicht-essentielle Aminosäuren, 1 % Anti-Anti und 0,1 mM β-Mercaptoethanol (alle Invitrogen) hinzugefügt18. Das Kollagen-I/iPSC-Konstrukt wurde in einer 96-Well-Platte mit einem Volumen von 100 μl pro Well verteilt. Das polymerisierte Gerüst wurde vor der In-vivo-Implantation im Tiermodell 5 Tage lang zur Vordifferenzierung in einen Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 gegeben. Für die Nur-Kollagen-Gerüstkontrolle wurde das obige Protokoll ebenfalls durchgeführt, die iPSCs wurden jedoch nicht hinzugefügt. Eine allgemeine Übersicht über den Prozess ist in der ergänzenden Abbildung S1 dargestellt.

Die Kollagen-I-Gerüste mit iPSCs wurden zu folgenden Zeitpunkten gesammelt: 0, 1, 3, 5, 8, 11, 13, 15, 18 und 21 Tage nach der Aussaat. Trizol (Invitrogen) wurde hinzugefügt und eine 26 ½-Gauge-Nadel wurde verwendet, um die Kollagen-/Zellmatrix im Trizol zu lysieren. Die RNA wurde unter Verwendung des vom Hersteller empfohlenen Protokolls isoliert. cDNA wurde mit dem High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (ThermoFisher) hergestellt. RT-PCR wurde auf einem ABI QuantStudio 6 unter Verwendung der Sonden Sp7 (Mm04209856_m1) und Bglap (Mm03413826_mH), Ibsp (Mm00492555_m1), Sox9 (Mm00448840_m1), Col2a1 (Mm01309565_m1), Oct4 (Mm03053917) durchgeführt _g1), Nanog (Mm02019550_s1) mit 18S ( Mm03928990_g1) als Haushaltskontrolle.

Die Zellen wurden durch Kollagenase-I-Behandlung in Einzelzellsuspensionen dissoziiert und zur Analyse einer Durchflusszytometrie unter Verwendung einer Attune NXT- und FlowJo-Software unterzogen. Pro Probe wurden mindestens zehntausend Ereignisse registriert, und die Analyse ganzer Zellen wurde unter Verwendung geeigneter Streutore durchgeführt, um Zelltrümmer und Aggregate zu vermeiden. Die Zellen wurden mit dem Annexin-PI-Kit (ThermoFisher) gemäß den Anweisungen des Herstellers gefärbt.

MPC-Linienverfolgungsmäuse (Hic1cre-ERT2:ROSAtdTomato) auf einem C57BL/6-Hintergrund wurden von Dr. T. Michael Underhill (University of British Columbia) bereitgestellt. In dieser Studie wurden sowohl Männer als auch Frauen im Alter von 8 bis 12 Wochen verwendet. Der Versuchsaufbau für die Knochenverletzung bei intakten Mäusen und Mäusen mit Ovarektomie (OVX) ist in der ergänzenden Abbildung S2 dargestellt.

In diesem Mausmodell wurden die endogenen MPCs dauerhaft mit tdTomato-Post-Tamoxifen-Induktion markiert. Mäuse wurden anästhesiert und erhielten intraperitoneale Injektionen des aktiven Isomers von Tamoxifen ((Z)-4-Hydroxytamoxifen, Sigma), gelöst in sterilisiertem Sonnenblumenöl. Den Mäusen wurden 4 Tage lang einmal täglich 100 μl Tamoxifen-Lösung (100 mg/kg) injiziert, gefolgt von einer einwöchigen Wartezeit, um die Rekombination zu ermöglichen.

Eine Woche nach der letzten Tamoxifen-Injektion wurde eine Bohrlochverletzung (nicht kritische Größe) durchgeführt. Die Bohrlochverletzung wurde nach zuvor von Taiani et al.12,13,19 beschriebenen Verfahren durchgeführt, die gegenüber zuvor von Uusitalo et al.20 veröffentlichten Methoden modifiziert wurden. Mäuse wurden mit veterinärmedizinischem Isofluran anästhesiert und 0,1 ml Buprenorphin wurden zuvor subkutan verabreicht zur Operation. Mit einem Hochgeschwindigkeits-Mikrobohrer (Fine Science Tools) wurde ein Loch mit 0,7 mm Durchmesser in die Markhöhle (ohne die gegenüberliegende Seite zu beschädigen) der Metaphyse der proximalen Tibia gebohrt19.

Im homöostatischen Frakturmodell wurden Mäuse in drei Gruppen eingeteilt: unbehandelte Kontrolle, leeres Kollagen I-Konstrukt und Kollagen I + iPSCs. Unmittelbar nach der Bohrlochverletzung wurde die Haut unbehandelter Kontrollmäuse geklammert, um die Einschnittstelle zu schließen. Bei den mit leerem Kollagen I und Kollagen I + iPSC behandelten Mäusen wurden 100 µl Gel mit (100.000 iPSCs pro Maus) oder ohne Zellen in den Bohrlochdefekt implantiert. Die Inzisionsstelle wurde dann mit Klammern verschlossen und die Mäuse wurden direkt nach der Operation in ihre Käfige zurückgebracht und durften das Gewicht tragen.

Ähnlich dem experimentellen Design des homöostatischen Frakturheilungsmodells erhielt Hic1cre-ERT2:ROSAtdTomato vier Tage lang einmal täglich intraperitoneale Tamoxifen-Injektionen. Eine Woche nach der letzten Tamoxifen-Injektion erhielten die Mäuse eine OVX-Operation. Kurz gesagt, Mäuse wurden vor der Operation anästhesiert und erhielten 0,1 ml Buprenorphin. Beide Eierstöcke wurden lokalisiert und herausgeschnitten. Eine Woche nach der OVX-Operation wurde eine Bohrlochoperation durchgeführt. Die OVX-Mäuse wurden in drei Gruppen eingeteilt: unbehandelte OVX-Kontrolle, OVX-leeres Kollagen-I-Konstrukt und OVX und Kollagen I + iPSCs.

Die Tibiae wurden entkalkt, bearbeitet und in Paraffinwachs eingebettet und bei 10 μm im Querschnitt angefertigt. Es wurden Safranin-O/Fast-Green-Färbung und Immunfluoreszenz durchgeführt. Die verwendeten spezifischen Marker waren: TdTomato, GFP, Anti-Mo/Rt Ki-67 eFluor 660 Klon SolA15 (Invitrogen, Ki67), Knochensialoprotein (BSP) Klon WVID1(9C5) (Developmental Studies Hybridoma Bank). Die Objektträger wurden mit EverBrite™ Hardset-Eindeckmedium mit DAPI (Biotium) behandelt und mit dem Zeiss Axioscan-Mikroskop abgebildet.

Für die quantitative Analyse wurde der interessierende Bereich als digitale Graustufenbilder erfasst. Zellen eines bestimmten Phänotyps wurden mithilfe der TissueQuest-Software (TissueGnostics) identifiziert und quantifiziert, wobei die Grenzwerte im Verhältnis zu den Negativkontrollen (nicht gefärbte und sekundäre alleinige Kontrollen) bestimmt wurden. Anhand dieser Schwellenwerte wurden das Gating und die Quantifizierung einfach/doppelt positiver Zellen durchgeführt.

Bei C57BL/6-Mäusen (normal und OVX) wurde Röntgenmikroskopie (XRM) eingesetzt, um die Knochenstruktur und Kallusbildung im Verletzungsbereich zu beurteilen. Die Tibia (einschließlich Weichgewebe und Muskeln) wurden geerntet und 24 Stunden lang in 10 % neutral gepuffertem Formalin (NBF) fixiert. Nach 24 Stunden wurden alle Weichteile und Muskeln vom Knochen entfernt. Die Proben wurden bis zur XRM-Bildgebung in 70 %igen Alkohol gegeben. Um Proben für die XRM vorzubereiten, wurde das Schienbein aus dem Alkohol entfernt und mit Schaumstoff in einem aufrechten Halter befestigt. PBS wurde verwendet, um die Hydratation während der Bildgebung sicherzustellen. Drei Calciumhydroxylapatit (CHA)-Knochenkalibrierungsphantome (Dichten 50, 1000 und 1200 mg/cm3) wurden bündig auf einer dünnen Schaumstoffschicht platziert und mit Klebeband am Halter befestigt. Niedrigenergie-XRM-Scans (40 kVp Spannung, 3 W Leistung) wurden mit einem 4-fach-Objektiv durchgeführt. Die Belichtungszeit jeder Projektion betrug 3 s und pro Rotation wurden 2001 Projektionen gesammelt. Die Bilder wurden auf eine isotrope Voxelgröße von 4,9 μm rekonstruiert. Die aus dem XRM-Scan erhaltenen Rohdaten wurden mit der Amira-Software und benutzerdefinierten SimpleITK-Skripten (v0.10.0, http://www.simpleitk.org/)21 verarbeitet. Alle Schnitte, die den Bohrlochdefekt enthielten, wurden segmentiert, einschließlich des Bereichs bis zum Ende des kortikalen Knochens und aller neu gebildeten Knochenkallus, die sich von der Defektstelle aus erstrecken (ergänzende Abbildung S3). Mit ITK-SNAP (v3.8.0, http://www.itksnap.org/)22 wurden interessierende Bereiche (ROIs) in den CHA-Kalibrierungsphantomen platziert, um Kantenartefakte zu vermeiden. Die durchschnittliche lineare Dämpfung wurde in jedem ROI berechnet und eine lineare Kalibrierungsgleichung wurde angepasst, um die XRM-Bilder zu kalibrieren. Für alle Kalibrierungen gilt R2 > 99 %. Zur Segmentierung vollständig mineralisierten Gewebes wurde ein Dichteschwellenwert von 800 mg/cm3 verwendet. Der Volumenbruch des Kallusknochens (BV/TV) wurde als Anzahl der vollständig mineralisierten Voxel in der Kallussegmentierung dividiert durch die Gesamtzahl der Voxel in der Kallussegmentierung berechnet. Die Knochenmineraldichte (BMD) des Kallus wurde als durchschnittliche Dichte innerhalb der Kallussegmentierung berechnet. Kallus-Renderings wurden mit der Software ParaView (5.7.0) erstellt. Es wurden drei Filter angewendet: (1) Schwellenwert – bei mindestens 0,5, (2) Oberfläche extrahieren und (3) Glätten – bei 400 Iterationen.

Alle Daten wurden mit GraphPad Prism 9 analysiert. Alle Datensätze, die mehr als zwei Versuchsgruppen enthielten, wurden mit einer einfaktoriellen Varianzanalyse (ANOVA) mit einem 95 %-Konfidenzintervall (α = 0,05) und einem Post-hoc-Test nach Fisher's LSD analysiert . Datensätze, die nur zwei Gruppen enthielten, wurden mithilfe eines zweiseitigen, ungepaarten parametrischen t-Tests mit einem 95 %-Konfidenzintervall (α = 0,05) analysiert.

Um zu bestätigen, dass die modifizierten iPSCs die Fähigkeit behalten, sich in alle drei Keimschichten zu differenzieren, wurde eine Teratomanalyse durchgeführt und Gewebe aus allen drei Keimschichten, einschließlich Knochen, beobachtet (ergänzende Abbildung S4).

Kollagen-I-Gerüste mit iPSCs wurden über einen Zeitraum von 21 Tagen der Differenzierung in vitro gesammelt und auf die Expression der osteogenen Marker Sp7, Bglap und Ibsp untersucht; chondrogene Marker Sox9 und Col2a1; pluripotente Marker Oct4 und Nanog (Ergänzende Abbildung S4). In Kollagen-I-Gerüst ausgesäte iPSCs (bei 100.000 Zellen/100 μl) zeigten eine erhöhte Expression von Sp7 Bglap und Ibsp. Die Sp7-Expression erreichte am Tag 1 der Differenzierung ihren Höhepunkt im Vergleich zu Bglap und Ibsp, die am Tag 15 bzw. 11 ihren Höhepunkt erreichten (ergänzende Abbildung S4). In den ersten 7 Tagen der Differenzierung wurden keine chondrogenen Marker nachgewiesen, und dann wurde sowohl die Sox9- als auch die Col2A1-Expression beobachtet, die am 18. bzw. 15. Tag ihren Höhepunkt erreichte (ergänzende Abbildung S4). Während die Expression pluripotenter Marker (Oct4 und Nanog) in undifferenzierten iPSCs nachgewiesen wurde, wurde am siebten Tag der Differenzierung keiner der Marker nachgewiesen (ergänzende Abbildung S4). Auch die Lebensfähigkeit der Zellen im Kollagengerüst wurde während der Differenzierungsphase mittels Durchflusszytometrie untersucht. Die undifferenzierten iPSCs waren zum Zeitpunkt ihrer Einsaat in die Gerüste zu etwa 97 % lebensfähig und sanken nach 5 Tagen im Gerüst (Zeitpunkt der Transplantation) auf etwa 72 %. Am Ende der In-vitro-Differenzierungsperiode waren ~ 15 % der Zellen lebensfähig (ergänzende Abbildung S4).

Bevor die Wechselwirkung von endogenen MPCs mit exogenen iPSCs nach der Verletzung untersucht wurde, wurde die Lokalisierung von Hic1 + -MPCs mit Abstammungslinie in unverletzten Knochen von Mäusen 7 Tage nach der Tamoxifen-Induktion untersucht (ergänzende Abbildung S5). In unverletzten Knochen waren MPCs auf Knochenoberflächen (periostal und endostal) lokalisiert. Im kortikalen Knochen gab es wenige Hic1+-MPCs und nur eine kleine Fraktur dieser exprimierten BSP. Allerdings kam es innerhalb der Knochenmarkhöhle zu einem Anstieg der Hic1+-Population um ca. 10 % dieser Zellen exprimieren Knochensialoprotein (BSP) und ca. 20% exprimieren Ki67 (Ergänzende Abbildung S5A – F).

3 (Abb. 1) und 7 (Abb. 2) Tage nach der Verletzung ohne Behandlung; Abstammungsbasierte MPCs waren zu beiden Zeitpunkten im kortikalen Bereich der Verletzung und am Tag 7 in der Knochenmarkhöhle angereichert (Abb. 1, 2). Zu beiden Zeitpunkten wurde eine gemeinsame Lokalisierung von tdTomato und BPS in der Markhöhle, angrenzenden endostalen Knochenoberflächen und der Verletzungsstelle mit dem kortikalen Knochen beobachtet (Abb. 1, 2D–F, J). Während am 3. Tag innerhalb der Verletzungsstelle eine minimale Zellproliferation (Ki67) beobachtet wurde, wurde am 7. Tag eine starke Ki67-Färbung an der gesamten Verletzungsstelle, einschließlich der Knochenmarkhöhle, beobachtet (Abb. 1, 2G–I). Drei Tage nach der Verletzung exprimierte nur ein geringer Anteil der tdTomato-positiven Zellen auch Ki67 (Abb. 1G–I, K), wobei am Tag 7 nach der Verletzung ein dramatischer Anstieg der doppelt positiven tdTomato- und Ki67-Zellen beobachtet wurde (Abb. 2G). -ICH K).

Abstammungsverfolgung von MPCs 3 Tage nach der Verletzung ohne Intervention. Die Lokalisierung von MPCs mit Hic1+-Linienverfolgung (tdTomato D–I), BSP (D–F) und Ki67 (G–I) wird vorgestellt. Ein repräsentatives Safranin-O-Bild zeigt das Vorhandensein einer Proteoglycan-Färbung innerhalb der Verletzungsstelle (A–C). Maßstabsbalken in (A,D,G) = 200 µm, Maßstabsbalken in den übrigen Zahlen = 100 µm. Repräsentative Gewebezytometrie-Gates aus denselben Gruppen (J,K).

Abstammungsverfolgung von MPCs 7 Tage nach der Verletzung ohne Intervention. Die Lokalisierung von MPCs mit Hic1+-Linienverfolgung (tdTomato D–I), BSP (D–F) und Ki67 (G–I) wird vorgestellt. Ein repräsentatives Safranin-O-Bild zeigt das Vorhandensein einer Proteoglycan-Färbung innerhalb der Verletzungsstelle (A–C). Maßstabsbalken in (A,D,G) = 200 µm, Maßstabsbalken in den übrigen Zahlen = 100 µm. Repräsentative Gewebezytometrie-Gates aus denselben Gruppen (J,K).

Wenn die Verletzung nur mit Kollagen-I-Gerüsten (keine iPSCs) behandelt wurde (Abb. 3, 4A–C), wurden MPCs mit Abstammungsnachweis innerhalb der kortikalen Verletzungsstelle, der Markhöhle und der endostalen Oberflächen sowie der periostalen Oberfläche des Knochens beobachtet sowohl am 3. als auch am 7. Tag nach der Verletzung (Abb. 3, 4D–F). Zu beiden Zeitpunkten wurde an der gesamten kortikalen Verletzungsstelle und in der Knochenmarkhöhle eine starke BSP-Färbung beobachtet (Abb. 3, 4D–F). Während zu beiden Zeitpunkten nur wenige Ki67+-Zellen innerhalb der kortikalen Verletzungsstelle beobachtet wurden, wurden Ki67+-Zellen 3 Tage nach der Verletzung in der Markhöhle beobachtet, wobei am 7. Tag nach der Verletzung eine offensichtliche Verringerung der positiven Zellen zu verzeichnen war (Abb. 3, 4G–I). ). Sowohl 3 als auch 7 Tage nach der Verletzung exprimierten ~ 40–50 % der Hic1+-Zellen auch BSP und ~ 20 % dieser Hic1-Linien-verfolgten Population proliferierten innerhalb der kortikalen Verletzungsstelle (Abb. 3, 4J, K). Innerhalb der Knochenmarkhöhle exprimierten ~ 25 % der Hic1+-Zellen auch BSP und ~ 10 % dieser Hic1-Linien-verfolgten Population proliferierten 3 Tage nach der Verletzung innerhalb der kortikalen Verletzungsstelle (Abb. 3J, K). Sieben Tage nach der Verletzung (Abb. 4A–C) exprimierten fast alle Hic1+-Zellen auch BSP und ~ 60 % dieser Zellpopulation exprimierten auch Ki67 (Abb. 4J, K).

Abstammungsverfolgung von MPCs 3 Tage nach der Verletzung mit Implantation von Kollagengerüsten. Die Lokalisierung von MPCs mit Hic1+-Linienverfolgung (tdTomato D–I), BSP (D–F) und Ki67 (G–I) wird vorgestellt. Ein repräsentatives Safranin-O-Bild zeigt das Vorhandensein einer Proteoglycan-Färbung innerhalb der Verletzungsstelle (A–C). Maßstabsbalken in (A,D,G) = 200 µm, Maßstabsbalken in den übrigen Zahlen = 100 µm. Repräsentative Gewebezytometrie-Gates aus denselben Gruppen (J,K).

Abstammungsverfolgung von MPCs 7 Tage nach der Verletzung mit Implantation von Kollagengerüsten. Die Lokalisierung von MPCs mit Hic1+-Linienverfolgung (tdTomato D–I), BSP (D–F) und Ki67 (G–I) wird vorgestellt. Ein repräsentatives Safranin-O-Bild zeigt das Vorhandensein einer Proteoglycan-Färbung innerhalb der Verletzungsstelle (A–C). Maßstabsbalken in (A,D,G) = 200 µm, Maßstabsbalken in den übrigen Zahlen = 100 µm. Repräsentative Gewebezytometrie-Gates aus denselben Gruppen (J,K).

Wenn Kollagengele mit iPSCs beladen und in die Verletzungsstelle implantiert wurden, wurde eine starke GFP-Expression an der Stelle der kortikalen Verletzung sowie in der Markhöhle 3 Tage nach der Verletzung beobachtet (Abb. 5A–I). Es wurde durchgehend eine BSP-Färbung beobachtet den gesamten Verletzungsbereich und ist gleichzeitig mit GFP- (iPSC) und tdTomato-positiven Zellen (Lineage Traced MPCs) lokalisiert (Abb. 5D – F, J). Im Gegensatz zu unbehandelten und mit Kollagen I allein behandelten Verletzungen wurde eine minimale Ki67-Färbung in den kortikalen oder Markhöhlenregionen mit geringer bis keiner Koexpression innerhalb von GFP oder tdTomato-positiven Zellen beobachtet (Abb. 5G–I,K). Sieben Tage nach der Verletzung (Abb. 6A–I) war an der gesamten Verletzungsstelle immer noch eine GFP-Färbung zu beobachten, die jedoch in der Knochenmarkhöhle im Vergleich zur kortikalen Verletzungsstelle verstärkt war. Es wurden nur wenige bis keine tdTomato-Zellen beobachtet. Während der gesamten Verletzung wurde auch eine BSP-Färbung beobachtet und eine Co-Lokalisierung mit dem GFP-Signal festgestellt (Abb. 6D – F, J). Es wurde eine minimale Ki67-Expression festgestellt und nur wenige GFP- oder tdTomato-Zellen exprimierten Ki67 (Abb. 6G – I, K).

Abstammungsverfolgung von MPCs bei Verletzungen, die mit iPSCs in Kollagen-I-Gerüsten behandelt wurden, 3 Tage nach der Verletzung. Kollagen-I-Gerüste mit 100.000 iPSCs wurden in Verletzungen injiziert und die Tiere wurden 3 Tage nach der Behandlung getötet (A,B). Die Lokalisierung von iPSCs (GFP) und Hic1+-Linien-verfolgten MPCs (tdTomato) wurde in Bezug auf die BSP- (D–F) oder Ki67-(G–I)-Färbung untersucht. Maßstabsbalken in (A,D,G) = 200 µm, Maßstabsbalken in den übrigen Figuren = 100 µm. Repräsentative Gewebezytometrie-Gates aus denselben Gruppen (J,K).

Abstammungsverfolgung von MPCs bei Verletzungen, die mit iPSCs innerhalb von Kollagen-I-Gerüsten behandelt wurden, 7 Tage nach der Verletzung. Kollagen-I-Gerüste mit 100.000 iPSCs wurden in Verletzungen injiziert und die Tiere wurden 7 Tage nach der Behandlung getötet (A,B). Die Lokalisierung von iPSCs (GFP) und Hic1+-Linien-verfolgten MPCs (tdTomato) wurde in Bezug auf die BSP- (D–F) oder Ki67-(G–I)-Färbung untersucht. Maßstabsbalken in (A,D,G) = 200 µm, Maßstabsbalken in den übrigen Figuren = 100 µm. Repräsentative Gewebezytometrie-Gates aus denselben Gruppen (J,K).

Die in der Studie verwendeten Zellmarker wurden quantifiziert, um zu bestimmen, ob sich die Anzahl oder das Schicksal der endogenen (MPCs) Vorläuferpopulationen nach der Verletzung im kortikalen Verletzungsbereich und/oder in der Markhöhle mit oder ohne Zugabe von exogenen iPSCs veränderte (ergänzende Abb. S6). Bei den unbehandelten Kontrollen beobachteten wir einen Anstieg der Anzahl an Zellen, MPCs (tdTomato), proliferierenden MPCs (tdTomato+Ki67+) und MPCs, die ein osteoblastisches Schicksal annahmen (tdTomato+BSP+), vom Tag 3 bis zum Tag 7 nach der Verletzung in der Kortikalis und Markhöhlenregionen (Ergänzende Abbildung S6A, B). Als Kollagen-I-Gerüste eingeführt wurden, schien es eine Tendenz in Richtung Differenzierung vs. Proliferation zu geben, da weniger tdTomato+Ki67+-Zellen beobachtet wurden, es jedoch immer noch einen Anstieg an tdTomato+BSP+-Zellen innerhalb der Verletzungsstelle gab (ergänzende Abbildung S6C, D). Durch die Zugabe von exogenen iPSCs zum Kollagen-I-Gerüst wurde die Zellproliferation innerhalb der gesamten Verletzungsstelle gedämpft, während weiterhin BSP-positive Zellen beobachtet wurden. Es scheint jedoch, dass die Mehrheit dieser BSP-positiven Zellen von den exogenen iPSCs stammte, wobei die endogenen MPCs nur einen geringen Beitrag zur BSP + -Population leisteten (ergänzende Abbildung S6E, F).

Um besser zu verstehen, wie endogene MPCs auf Verletzungen unter nicht homöostatischen Bedingungen reagieren, wurde die Bohrlochverletzung bei osteopenischen/porotischen Mäusen (post-OVX) induziert. Immunfluoreszenz wurde verwendet, um die Position der MPCs mit Herkunftsnachweis 7 Tage nach der Verletzung zu identifizieren. Die nach der Abstammung verfolgten MPCs wurden im kortikalen Knochen und in der Knochenmarkhöhle beobachtet, wobei auch an den Knochenoberflächen (periostal und endostal) eine Färbung beobachtet wurde. Die Co-Lokalisierung von tdTomato mit BSP und Ki67 wurde in der Markhöhle beobachtet, und die Co-Lokalisierung von tdTomato mit BSP wurde auch im kortikalen Knochen beobachtet. Im kortikalen Knochen wurde jedoch eine minimale Ki67-Expression oder Co-Lokalisierung mit tdTomato beobachtet (ergänzende Abbildung S7A – H).

7 Tage nach der Verletzung und 14 Tage nach der OVX (in Abwesenheit von Kollagen-I-Gerüsten ± iPSCs) wurden zusätzlich zur Knochenmarkhöhle an der kortikalen Knochenverletzungsstelle MPCs mit Abstammungsverfolgung beobachtet (Abb. 7A – I). An der gesamten Verletzungsstelle wurde eine gemeinsame Lokalisierung von tdTomato mit BSP oder Ki67 beobachtet (Abb. 7A – K).

Abstammungsverfolgung von MPCs in OVX-Mäusen 7 Tage nach der Verletzung ohne Intervention. Die Lokalisierung von MPCs mit Hic1+-Linienverfolgung (tdTomato D–I), BSP (D–F) und Ki67 (G–I) wird vorgestellt. Ein repräsentatives Safranin-O-Bild zeigt das Vorhandensein einer Proteoglycan-Färbung innerhalb der Verletzungsstelle (A–C). Maßstabsbalken in (A,D,G) = 200 µm, Maßstabsbalken in den übrigen Zahlen = 100 µm. Repräsentative Gewebezytometrie-Gates aus denselben Gruppen (J,K).

Bei der Behandlung von OVX-Mäusen mit Kollagen-I-Gerüsten allein (keine iPSCs) (Abb. 8) wurde an der gesamten Verletzungsstelle eine robuste tdTomato-Expression beobachtet (Abb. 8A – I). BSP wurde auch an der gesamten Verletzungsstelle beobachtet, wobei sowohl im kortikalen als auch im Markhöhlenbereich eine intensive Färbung beobachtet wurde (Abb. 8A – F). Während an der gesamten Verletzungsstelle auch eine Ki67+-Färbung beobachtet wurde, war die Färbung im kortikalen Verletzungsbereich verstärkt (Abb. 8G – I). Die Co-Lokalisierung von tdTomato mit BSP und Ki67 wurde in den kortikalen und Markhöhlenregionen beobachtet (Abb. 8J – K).

Abstammungsverfolgung von MPCs in OVX-Mäusen 7 Tage nach der Verletzung mit Implantation von Kollagengerüsten. Die Lokalisierung von MPCs mit Hic1+-Linienverfolgung (tdTomato D–I), BSP (D–F) und Ki67 (G–I) wird vorgestellt. Ein repräsentatives Safranin-O-Bild zeigt das Vorhandensein einer Proteoglycan-Färbung innerhalb der Verletzungsstelle (A–C). Maßstabsbalken in (A,D,G) = 200 µm, Maßstabsbalken in den übrigen Zahlen = 100 µm. Repräsentative Gewebezytometrie-Gates aus denselben Gruppen (J,K).

Wenn Kollagengerüste mit iPSCs beladen und in die Verletzungsstelle implantiert wurden, wurde eine GFP-Expression sowohl im kortikalen Verletzungsbereich als auch in der Markhöhle beobachtet (Abb. 9A–I). Ähnlich wie bei der Injektion von iPSCs in die Verletzungen intakter Mäuse wurde kaum oder gar keine tdTomato-Färbung beobachtet. Dennoch wurde an der gesamten Verletzungsstelle immer noch eine BSP-Färbung beobachtet, die zusammen mit der GFP (iPSC)-Expression lokalisiert war (Abb. 9J). An der Verletzungsstelle (Kortikalis- oder Markhöhlenregionen) wurde eine geringe bis keine Ki67-Färbung beobachtet, und es wurde eine minimale Co-Lokalisierung von Ki67 mit der GFP-Expression beobachtet (Abb. 9G – I, K).

Abstammungsverfolgung von MPCs in OVX-Mäusen, die 7 Tage nach der Verletzung mit iPSCs in Kollagen-I-Gerüsten behandelt wurden. Kollagen-I-Gerüste mit 100.000 iPSCs wurden in Verletzungen injiziert, wobei die Tiere 7 Tage nach der Behandlung getötet wurden (A,B). Die Lokalisierung von iPSCs (GFP) und Hic1+-Linien-verfolgten MPCs (tdTomato) wurde in Bezug auf die BSP- (D–F) oder Ki67-(G–I)-Färbung untersucht. Maßstabsbalken in (A,D,G) = 200 µm, Maßstabsbalken in den übrigen Figuren = 100 µm. Repräsentative Gewebezytometrie-Gates aus denselben Gruppen (J,K).

Die in der Studie verwendeten Zellmarker wurden in OVX-Mäusen quantifiziert (Ergänzende Abbildung S8). Bei den unbehandelten Verletzungen kam es im Kortikalis- und Markhöhlenbereich zu einem Anstieg aller untersuchten Zelltypen im Vergleich zur nicht verletzten Kontrolle (ergänzende Abbildung S8A, B). Durch die Zugabe des Kollagengerüsts (allein) kam es zu einem nahezu vollständigen Verlust proliferativer Zellen (einschließlich proliferativer MPCs), bei gleichzeitiger Zunahme von MPCs, die ein osteoblastisches Schicksal annahmen (tdTomato+BSP+) (Ergänzende Abb. S8C,D) . Als iPSCs in die Verletzungsstelle eingeführt wurden, wurde die Proliferation erneut gehemmt und die BSP+-Zellen in den kortikalen und Markhöhlenregionen stammten primär von den exogenen iPSCs (ergänzende Abb. S8E, F).

Um zu untersuchen, ob der Verlust der Knochenhomöostase (OVX) das Verhalten der endogenen und/oder exogenen Stamm-/Vorläuferpopulationen beeinflusst, wurden die in der Studie verwendeten Zellmarker quantifiziert (Abb. 10). Es wurden eine Reihe signifikanter Unterschiede zwischen der unverletzten und der verletzten Behandlungsgruppe beobachtet. Im unverletzten Knochen kam es zu einem Rückgang der Gesamtzahl der Zellen (DAPI+) im kortikalen Knochen zusätzlich zu einem Rückgang der proliferativen Zellen im Knochen nach OVX (Abb. 10A). In der Markhöhle des unverletzten OVX-Knochens kam es zu einer Abnahme der Anzahl der BSP exprimierenden Zellen und der BSP exprimierenden MPCs (tdTomato+BSP+) (Abb. 10B). Bei unbehandelten Verletzungen bestand der einzige Unterschied im kortikalen Bereich in einer Zunahme in der Anzahl der BSP+-Zellen in den OVX-Mäusen (Abb. 10C). In der Markhöhle dieser OVX-Mäuse gab es eine Abnahme der MPCs, BSP+-Zellen und MPCs mit Abstammungsnachweis, die BSP exprimierten (Abb. 10D). Bei den unbehandelten Mäusen gab es keine Unterschiede in der Proliferation.

Quantifizierung der Zellpopulationen innerhalb der Verletzungsstelle intakter vs. OVX-Mäuse. Die Daten der Gewebezytometrie wurden quantifiziert und die Ergebnisse statistisch untersucht. Die Anzahl der DAPI+, tdTomato+, BSP+, Ki67+, tdTomato+BSP+, tdTomato+Ki67, GFP+ iPSCs, GFP+Ki67+ GFP+BSP+ Zellpopulationen wurde in unverletzten (A,B), unbehandelten (C,D), Kollagengerüsten (E ,F) und Kollagengerüst plus iPSC (G,H) Behandlungsgruppen. ns = nicht signifikant. *p < 0,05.

Als die Kollagen-I-Gerüste in die Verletzungsstelle implantiert wurden, kam es zu einem dramatischen Anstieg der Menge an MPCs, BSP+-Zellen und MPCs, die BSP exprimierten, in der kortikalen Verletzungsstelle von OVX-Mäusen (Abb. 10E). Interessanterweise kam es bei OVX-Mäusen zu einer Abnahme der Anzahl proliferativer Zellen in der kortikalen Region und zu einer Zunahme proliferativer Zellen in der Markhöhle (Abb. 10E, F). Die auffälligsten Unterschiede zwischen intakten und OVX-Mäusen, die iPSCs erhielten, bestanden in der Markhöhle, wo es bei Mäusen, die OVX erhielten, zu einem dramatischen Rückgang der Gesamtzahl der Zellen und BSP+-Zellen kam (Abb. 10H).

Knochenparameter aus der Röntgenmikroskopie wurden quantifiziert, um das Volumen des neuen Knochens, der die Defektstelle füllt, und die Qualität des gebildeten Knochens zu bestimmen. Der Knochenvolumenanteil (BV/TV) und die Knochenmineraldichte (BMD) wurden bei allen Mäusen berechnet und quantifiziert (ergänzende Abbildung S9). Es gab einen signifikanten Rückgang des BV/TV 3 Tage nach der Verletzung, gefolgt von einem signifikanten Anstieg am Tag 7. Der gleiche Trend wurde in Gegenwart des Kollagengerüsts beobachtet (ergänzende Abbildung S9A). Als iPSCs eingeführt wurden, wurde an den Tagen 3 und 7 nach der Verletzung eine dramatische Verringerung des BV/TV beobachtet (ergänzende Abbildung S9A). Die gleichen Trends wurden bei der BMD für drei Mäuse, Behandlungsgruppen und Zeitpunkte beobachtet (ergänzende Abbildung S9C). Beim Vergleich intakter Mäuse mit OVX-Mäusen wurde erwartungsgemäß eine Abnahme von BV/TV und BMD im unverletzten OVX-Knochen beobachtet (ergänzende Abbildung S9B, D). Es wurden keine Unterschiede in der unbehandelten Gruppe und der Gruppe mit Kollagen-I-Gerüst allein in Bezug auf BV/TV beobachtet, aber beide Gruppen zeigten eine verringerte BMD bei den OVX-Mäusen (ergänzende Abb. S9B, D). Bei mit iPSCs behandelten OVX-Mäusen wurde ein signifikanter Anstieg des BV/TV gegenüber intakten Mäusen beobachtet, die BMD-Werte bei den Mäusen zeigten jedoch den gegenteiligen Effekt (Ergänzende Abb. S9B, D).

Diese Studie wurde durchgeführt, um ein besseres Verständnis der Wechselwirkungen zwischen endogenen und exogenen Stamm-/Vorläuferzellen während der Knochenheilung zu erlangen. Mithilfe eines hochreproduzierbaren Modells von Knochenverletzungen (z. B. Bohrloch) in intakten/normalen und osteoporotischen/osteopenischen (OVX) Mäusen konnten wir zeigen, dass es zu einer teilweisen Hemmung der endogenen MPC-Rekrutierung/-Funktion kommt, wenn exogene iPSCs verabreicht werden. Unseres Wissens ist dies das erste Mal, dass dieser Effekt nachgewiesen wurde, und diese Beobachtung erfordert weitere Untersuchungen, um festzustellen, ob eine Änderung der Verabreichungsart und/oder der Dosierung exogener Zellen diese Hemmung abschwächen und/oder möglicherweise sogar zu einer Synergie zwischen endogenen Zellen führen kann und exogene Populationen.

Obwohl es wichtig ist zu erkennen, dass unser Studiendesign nicht darauf abzielte, die Frakturheilung mit iPSCs zu optimieren/verbessern, konnten wir zeigen, dass die Verabreichung von iPSCs innerhalb eines osteogen modifizierten Kollagen-I-Gerüsts in einem beeinträchtigten Mausmodell zu einer verbesserten Frakturheilung führte Knochenhomöostase (OVX). Diese Ergebnisse stimmen mit zuvor veröffentlichten Studien aus unserem Labor14 und anderen23 überein, die zeigen, dass pluripotente Stammzellen (Maus oder Mensch) die Frakturreparatur in beeinträchtigten Modellen erleichtern können. Bei den normalen Mäusen füllte sich der unbehandelte Bohrlochbruch erwartungsgemäß sehr schnell mit Knochen7,12,24,25,26. Es war jedoch interessant festzustellen, dass die Behandlung mit Kollagen-I-Gerüst mit oder ohne iPSCs bei einer intakten Maus den normalen Heilungsprozess beeinträchtigte und zu gleichwertigen oder schlechteren Ergebnismessungen führte. Eine mögliche Erklärung hierfür ist das physische Vorhandensein des dichten Gerüsts, das möglicherweise die Zellrekrutierung und/oder den Umbau an der Verletzungsstelle behindert hat. Abgesehen von der physikalischen Beeinträchtigung durch das Kollagen ist es durchaus möglich, dass die Rekrutierung anderer osteochondraler Vorläufer durch die Anwesenheit von iPSCs und/oder anderen Zellpopulationen, die für die normale Knochenreparatur/Homöostase erforderlich sind (z. B. Osteoklasten), beeinträchtigt wurde. Darüber hinaus zeigte der an der Verletzungsstelle gebildete Knochen bei diesen mit iPSC behandelten Verletzungen im Vergleich zu den anderen Behandlungsgruppen eine unreife Morphologie ohne definierte Trabekelstruktur. Wir können jedoch nicht sicher sein, dass die iPSC selbst direkt zu diesem unreifen Knochenphänotyp beigetragen oder einfach den natürlichen Heilungsprozess bei diesen Mäusen verzögert haben. Abgesehen von einem Rückgang der MPCs mit Herkunftsnachweis innerhalb der Defekte, die iPSCs erhielten, beobachteten wir auch eine minimale BSP- und Ki67-Färbung in der MPC-Population im Vergleich zu den anderen Behandlungsgruppen (einschließlich Kollagen allein). Dies deutet darauf hin, dass es iPSCs waren, die das Verhalten der endogenen Vorläuferzellen veränderten und deren Fähigkeit zur proliferativen und osteogenen Differenzierung in dieser Verletzungsumgebung wirksam hemmten, was wahrscheinlich ihre Fähigkeit zur wirksamen Heilung des Bohrlochdefekts beeinträchtigte. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese mit iPSCs behandelten Bohrlochdefekte weniger Knochen bildeten als unbehandelte Kontroll- und mit Kollagen behandelte Gruppen, was offenbar auf weniger MPCs, gebundene Osteovorläufer/Osteoblasten (BSP+) und proliferierende Zellen im Allgemeinen (Ki67+) zurückzuführen ist. Dieses Ergebnis ist sehr interessant, da bereits zuvor gezeigt wurde, dass transplantierte iPSCs die Fähigkeit besitzen, die Proliferation endogener Zellen zu steigern, um eine Reparatur zu bewirken27,28. Es müsste eine Studie durchgeführt werden, die speziell darauf ausgelegt ist, diese Beobachtung direkt zu untersuchen, um festzustellen, warum dies während des normalen Reparaturprozesses von Knochenverletzungen nicht auftritt.

Das Verständnis der Auswirkungen der Verwendung von iPSCs auf den Knochenheilungsprozess ist für die Entwicklung evidenzbasierter Therapien in der Zukunft von entscheidender Bedeutung. Allerdings ist es auch wichtig zu bestimmen, wie diese Zellen mit den endogenen Populationen in einem beeinträchtigten Modell der Knochenbruchheilung (OVX) interagieren; da diese Umgebung die klinische Situation besser nachahmt, in der diese Art von Therapien eingesetzt würden. Die mit Kollagengerüst I plus iPSC behandelte Gruppe zeigte im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollen einen erhöhten BV/TV, zeigte jedoch keine Unterschiede in der Gesamt-BMD. Daher scheint es, dass die Behandlung mit iPSCs in einem Modell mit beeinträchtigter Knochenheilung wirksamer bei der Bildung neuen Knochens war. Dies könnte darauf hindeuten, dass in den intakten Mäusen eine Osteoklasten-iPSC-Wechselwirkung auftritt, die auch die natürliche Reparaturreaktion hemmt, und dass diese Wechselwirkung im OVX-Modell unterbrochen ist. Es ist auch möglich, dass die transplantierten iPSCs ein osteoklastisches Schicksal erleiden, da beobachtet wurde, dass die osteoblastischen/osteoklastischen Abstammungslinien von iPSCs in iPSCs plastischer sind23. Eine weitere interessante Beobachtung war, dass bei OVX-Mäusen, die mit dem Kollagengerüst ohne Zellen behandelt wurden, eine sehr geringe Knochenregeneration auftrat (weniger BV/TV im Vergleich zu iPSCs) und der vorhandene Knochen weniger ausgereift zu sein schien und keine definierte Trabekulation aufwies. Darüber hinaus färbte sich die gesamte Verletzungsstelle dieser Mäuse intensiv positiv für BSP. Wir haben bestätigt, dass dies keine Folge einer unspezifischen sekundären Antikörperbindung war. Dies deutet darauf hin, dass das BSP-Signal von anderen Quellen im Knochen oder systemisch stammen könnte. Es ist gut dokumentiert, dass BSP im Blut vorhanden ist und diese Werte aufgrund von Krankheiten29,30 wie Osteoporose31,32 erhöht sein können. Daher ist es möglich, dass das Kollagen-I-Gerüst allein als „Senke“ für erhöhte systemische BSP-Spiegel aufgrund des OVX fungiert. Es bleibt jedoch unklar, warum wir dies in der iPSC-Behandlungsgruppe nicht beobachtet hätten, es sei denn, es handelte sich um systemische Die BSP-Werte waren in dieser Gruppe verringert. Eine ELISA-Analyse des Serums würde Aufschluss über diese Hypothese geben.

Wie bei jeder wissenschaftlichen Forschungsstudie bestehen auch bei der vorliegenden Studie Einschränkungen. Während gezeigt wurde, dass Hic1 ein robuster Marker für MPCs ist,15,16,17 konnten wir durch die ausschließliche Untersuchung von Hic1-exprimierenden Zellen wahrscheinlich nicht alle in der erwachsenen Maus vorhandenen Subpopulationen von MPCs berücksichtigen. Beispielsweise wäre es interessant festzustellen, ob die Prx133-Linie bei der Bruchreparatur mit oder ohne iPSCs das gleiche Verhalten zeigte. Eine weitere potenzielle Einschränkung/Störquelle ist der Tag 7-Zeitpunkt, der auf der Grundlage früherer Erkenntnisse ausgewählt wurde, dass eine Woche nach der Bohrlochoperation bei normalen und OVX-Mäusen trabekulärer Knochen in der Markhöhle gebildet wird14. Um ein umfassenderes Verständnis der Knochenbruchheilung an der Verletzungsstelle zu entwickeln, wäre es wertvoll, spätere Zeitpunkte zu bewerten und/oder komplexere Frakturmodelle zu verwenden34.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Einführung induzierter pluripotenter Stammzellen (iPSCs) in eine Knochenverletzung bei intakten Mäusen zu einer Hemmung der Reparaturreaktion führte, bei beeinträchtigten (OVX) Mäusen jedoch die Menge an gebildetem Knochen erhöhte. Insbesondere führte die Einführung von iPSCs in die Verletzungsstelle bei intakten Mäusen zu einer verringerten Knochenbildung sowie einer verringerten endogenen MPC-Rekrutierung, -Proliferation und -Differenzierung. Darüber hinaus war die Knochenheilung, die bei mit iPSCs behandelten OVX-Mäusen beobachtet wurde, nicht auf eine erhöhte Rekrutierung oder osteogene Differenzierung endogener MPCs zurückzuführen, sondern wahrscheinlich auf die Differenzierung dieser iPSCs zu Osteoblasten. Weitere Forschung ist erforderlich, um die direkten und indirekten Mechanismen, über die iPSCs an der Knochenheilung beteiligt sind, besser aufzuklären, damit sie sicher in der evidenzbasierten Therapie zur Behandlung schwer heilender Pseudarthrose-Knochenbrüche eingesetzt werden können.

Die Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Referenzen herunterladen

Leah Ferrie wurde durch ein Osteoporose-Kanada-Stipendium unterstützt. Priyatha Premnath wurde durch ein Alberta Innovates Health Solutions Fellowship unterstützt. Alexandra Olsen wurde durch ein NSERC-Stipendium unterstützt. Roman Krawetz wird von einem Tier 2 Canada Research Chair unterstützt. Diese Arbeit wird durch Zuschüsse von NSERC und CIHR unterstützt. Wir möchten den Mitarbeitern der Cumming School of Medicine ARC für ihre Unterstützung bei der Tierhaltung danken; und Kent Paulson für die Unterstützung bei den biomechanischen Tests.

McCaig Institute for Bone and Joint Health, University of Calgary, Calgary, AB, Kanada

Leah Ferrie, Priyatha Premnath, Alexandra Olsen, Leila Larijani, Bryce A. Besler, Derrick E. Rancourt, Neil A. Duncan und Roman J. Krawetz

Graduiertenprogramm für Biomedizintechnik, University of Calgary, Calgary, AB, Kanada

Leah Ferrie, Alexandra Olsen, Bryce A. Besler, Derrick E. Rancourt, Neil A. Duncan und Roman J. Krawetz

College of Engineering and Applied Science, University of Wisconsin Milwaukee, Milwaukee, WI, USA

Priyatha Premnath

Abteilung für Biochemie und Molekularbiologie, Cumming School of Medicine, University of Calgary, Calgary, AB, Kanada

Leila Larijani und Derrick E. Rancourt

Fakultät für Bauingenieurwesen, Schulich School of Engineering, University of Calgary, Calgary, AB, Kanada

Neil A. Duncan

Abteilung für Zell- und Physiologiewissenschaften, University of British Columbia, Vancouver, BC, Kanada

T. Michael Underhill

Abteilung für Zellbiologie und Anatomie, Cumming School of Medicine, University of Calgary, Calgary, AB, Kanada

Roman J. Krawetz

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Konzeption und Design: LF, PP, RJK Analyse und Interpretation der Daten: LF, AO, BAB, RJK Verfassen des Artikels: LF Kritische Überarbeitung des Artikels für wichtige intellektuelle Inhalte: LF, PP, AO, LL, BAB, DER , NAD, TMU, RJK Endgültige Genehmigung des Artikels: LF, PP, AO, LL, BAB, DER, NAD, TMU, RJK Bereitstellung von Studienmaterialien: DER, TMU, RJK Einwerbung von Fördermitteln: RJK Sammlung und Zusammenstellung von Daten: LF, AO, RJK

Korrespondenz mit Roman J. Krawetz.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Ferrie, L., Premnath, P., Olsen, A. et al. Exogen zugeführte iPSCs stören die natürliche Reparaturreaktion endogener MPCs nach einer Knochenverletzung. Sci Rep 13, 9378 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36609-z

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Eingegangen: 07. Juli 2022

Angenommen: 07. Juni 2023

Veröffentlicht: 09. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36609-z

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